منبع مقاله درباره نشانگرهاي، 1388).، (نقوي

و همکاران، 1388).
1-9-1-نشانگرهاي مورفولوژيکي20
مندل، شايد نخستين کسي بود که از نشانگرهاي مورفولوژيک يا نشانگرهاي مبتني بر فنوتيپ براي مطالعه چگونگي توارث صفات در نخود فرنگي استفاده کرد. تفاوت در صفات قابل رويتي مانند رنگ گل، فرم گل و… به عنوان نشانگر مورفولوژيکي استفاده ميشوند (نقوي و همکاران، 1388). طبقهبندي بر مبناي نشانگرهاي مورفولوژيک بعلت معايبي چون ايجاد ردهبنديهاي متعدد در نتيجه معيارهاي متفاوت مورد استفاده جهت طبقهبندي، عدم امکان شناسايي دقيق تا زمان گلدهي، اثر مراحل رشدي بر خصوصيات مورفولوژيکي گياه، امکان شناسايي گياهان تنها توسط گياهشناسان خبره، فراواني و تنوع کم اين نشانگرها و اينکه گاهي براي ثبت آنها بايد منتظر ظهور آنها ماند و اين در گياهان چند ساله بسيار مشکل است (مومني و همکاران، 1392).
همچنين اثر محيط بر خصوصيات مورفولوژيک مانند وضعيت برگها و ارتفاع که حتي در داخل کلونها ممکن است باعث تفاوت ظاهري شود مورد اطمينان نيستند (مومني و همکاران، 1392). در نتيجه تعيين تنوع ژنتيکي اگر تنها بر اساس خصوصيات موفولوژيکي باشد ارزش کمي دارد (لاموت21 و همکاران، 2002).
1 -9-2-نشانگرها بيوشيميايي22
استفاده از نشانگرهاي بيوشيميايي در طول دهه 1970 ميلادي متداول شد. اين نشانگرها، پروتئينهايي هستند که در اثر بيان ژن توليد ميشوند که از طريق الکتروفورز و رنگآميزي، قابل جداسازي و تشخيص ميباشند. در سالهاي اخير به طو ر موفقيتآميزي به عنوان نشانگرهاي بيوشيميايي در اصلاح گياهان مورد استفاده قرار گرفتهاند. ايزوزايمها، فرمهاي مولکولي مختلف يک آنزيم با ماهيت پروتئيني هستند که واکنش يکساني را کاتاليز ميکنند (فارسي و باقري، 1385). همچنين تغييراتي در اسيدهاي آمينه آنها وجود دارد که از نظر وزن مولکولي، بارالکتريکي و ساختمان فضايي با هم تفاوت دارند و در ميدان الکتريکي داراي سرعت حرکت مختلفي هستند. و الوزايمها نيز زير گروهي ايزوزايمها هستند که توسط اللهاي مختلف يک ژن رمزگذاري ميشوند (ميردريکوند و همکاران، 1383). ايزوزايمها عموما همبارز23 ميباشند اما ضعف اصلي ايزوزايمها اين است که فرواني آنها نسبتا کم است و سطح چند شکلي پاييني دارند. همچنين اين نشانگرها تحت تاثير تغييرات پس از ترجمه هستند و تظاهر کمي برخي از آنزيمها و پروتئينها تحت تاثير مرحله رشد گياه قرار ميگيرد (نقوي و همکاران، 1388).
1-9-3-نشانگرهاي DNA
از بدو تولد ژنتيک و اصلاح نباتات مدرن در اوايل قرن 19، نشانگرهاي ژنتيکي، براي انتخاب غيرمستقيم صفات مطلوب و حذف صفات نامطلوب، ردهبندي و بررسيهاي فيلوژنتيکي و تنوع ژنتيکي استفاده شدند (گاستيمسکي24 و همکاران، 2005).
کشف انواع مختلف آنزيمهاي محدودگر25 در 1970 و همچنين کشف واکنش زنجيرهاي پليمراز در 1987 فرصت مناسبي را براي بررسي تنوع و تفاوت موجودات مختلف در سطح DNA امکانپذير کرده است (نقوي و همکاران، 1388). نشانگرهاي مولکولي DNA، تواليهاي نوکلئوتيدي چند شکلي هستند که در سرتاسر ژنوم پراکندهاند که جهش در آنها با استفاده از تکنيکهايي همچون PCR26 قابل رديابي است (گاستيمسکي وهمکاران، 2005). اين نشانگرها تفاوتهاي موجود در سطح DNAرا که هيچ تظاهري در ظاهر و يا پروتئينها ندارند آشکار ميکنند. اين دسته از نشانگرها، که تعدادشان تقريبا نامحدود است، فقط از طريق تجزيه و تحليل مستقيم DNA قابل ثبت هستند(نقوي و همکاران، 1388و گودوين و همکاران، 1997).
کاربرد نشانگرهاي DNA، بسياري از مشکلات مرتبط نشانگرهاي مورفولوژيکي و ايزوزايمي را بر طرف ميکند (گودوين27 و همکاران، 1997).
نشانگرهاي مولکولي DNAرا ميتوان به دو گروه دستهبندي کرد (1) روشهاي غير مبتني بر PCR يا روشهايي بر اساس هيبريداسيون28 (2) روشهاي مبتني بر PCR
برخي از مزاياي نشانگرهاي مولکولي در سطح DNA عبارتست از:
1.فراواني فوقالعاده
2.عدم تاثير پذيري از شرايط محيط خارجي
3.امکان بکار گيري در مراحل نخستين رشد گياه
4.فراهم نمودن امکان مطالعه گياهان در خارج از فصل و محل کشت
5.دقت و قابليت مطلوب تفسير نتايج
6.امکان استفاده از آنها در گونههاي منقرض شده
7.دسترسي به برنامههاي رايانهاي قوي براي تجزيه و تحليل و تفسير سريع نتايج (نقوي و همکاران، 1388).
8.حساسيت در تشخيص تفاوتهاي ژنتيکي جزئي (لاموت و همکاران، 2002).
عموماً روشهاي مبتني بر PCR به علت سرعت، سادگي، اختصاصي بودن و حساسيت بر روشهاي ديگر ترجيح داده ميشوند (باقري و همکاران، 1386).
1-10-انواع نشانگرهاي مولکولي جديد
1-10-1-RFLP29
نشانگرهاي مولکولي DNA عموما چند شکلي توالي DNA را بدون توالييابي بررسي و ارزيابي ميکنند. اولين نسل نشانگرهاي DNA بر مبناي هيبريداسيون کاوشگر با توالي خاصي از DNA شکل گرفتهاند. از جمله نشانگرهاي مبتني بر هيبريداسيون، ميتوان به نشانگرهاي RFLP که بر مبناي تنوع طولي قطعات حاصل از برش توسط آنزيمهاي برشي شکل گرفتهاند اشاره نمود (باقري و همکاران، 1386). پليمرفيسمهاي30 طولي قطعات برشي (RFLP)، با استفاده از آنزيمهاي برشي31، مولکولهاي DNA ژنومي را در توالي هاي نوکلئوتيدي خاصي (محل هاي برش) برش داده و بنابراين قطعات DNA با اندازه هاي مختلف را بوجود مي آورند(بوتستين و همکاران32، 1980).
از معايب RFLP ميتوان به موارد ذيل اشاره نمود:
دشواري، پيچيدگي و وقتگير بودن آن
RFLP ژنومهاي بزرگ نيازمند کاربرد مواد پرتوزا يا روشهاي پيچيدهتر و گرانتر بيوشيميايي است.
هزينه اوليه زياد و هزينه نسبتا زياد نگاهداري کاوشگرها و کاربرد آنها، RFLP را گران کرده است.
در گونههاي بسيار نزديک به همديگر اين نوع نشانگرها آللهاي مشابهي را نشان ميدهند (نقوي و همکاران، 1388)
ج
1-10-2-RAPD33
در سال 1990 تکنيکي به نام DNA چند شکل تکثير شده تصادفي يا اختصاراً RAPD توسط دو گروه مستقل ويليامز و همکاران و لش و همکاران معرفي شد، که اساس آن تکثير نواحي اتصال پرايمر در DNA ژنوم، با استفاده از واکنش PCR ميباشد (نقوي و همکاران، 1388). اتصال رقابتي آغازگرها و توليد باندهاي مصنوعي و برهمکنش داخل و بين رشته DNA در طي PCR، هنوز بعنوان يک مشکل بالقوه RAPD پا برجاست. بنظر ميرسد برخي از اين مشکلات مانند تکرارپذيري، احتمالاً بعلت آغازگرهاي طويلتر و دماي اتصال بالاتر، براي 34AFLP و ISSR35، از RAPD کمتر است (نيبوم36، 2004).
نتايج اين تکنيک معمولاً در پاسخ به تغييرات کوچک مانند شدت اتصال آغازگر، که شرايط آزمايشي آن را تغيير ميدهد به ميزان زيادي متغير است. بنابر اين قابليت تکرارپذيري و امکان استفاده از آن در آزمايشگاههاي مختلف در اين تکنيک بعضاً دچار مشکل شده و کاربرد آن را محدود ميکند (سلطانلو و همکاران، 1388).
1-10-3- AFLP37
اين نشانگر اولين بار در سال 1395 توسط ووس و همکاران معرفي شد. AFLP، تکنيکي بر پايه تکثير بخشي از قطعات هضم شده حاصل از هضم DNA کلي با استفاده از PCR است. محصولات تکثير شده با رنگهاي فلورسنت يا رادواکتيو نشاندار شده و بر روي ژل توالييابي و تفکيک مي شوند. اين تکنيک ابزار مولکولي قوي و قابل اعتمادي در بررسي چند شکلي DNA است (لاموت و همکاران، 2002).
پيچيدگي نسبي در مقايسه با ساير روشهاي مبتني بر PCR و غالب بودن اين نشانگر که موجب عدم امکان تشخيص افراد خالص از ناخالص ميگردد، استفاده از اين تکنيک را محدود ميکند. همچنين هضم ناقص DNA باعث توليد باندهاي مصنوعي ميشود و رديابي اين مشکل سخت است مگر اينکه نمونهبرداري از بافت گياه در مراحل مختلف در طي فصل رشد و از اندامهاي مختلف انجام شود (نيبوم، 2004).
از معايب اين نشانگر ميتوان به موارد ذيل اشاره نمود:
پيچيدگي نسبي اين روش در مقايسه با ساير روشهاي مبتني بر PCR
عدم اطلاع از جايگاه ژني نشانگرها
1-10-4- SSR38
ژنوم موجودات عالي، انباشه از نسخههاي متعدد تواليهاي ساده DNA ميباشند که با اندازههاي مختلف در تمام طول ژنوم پراکنده شدهاند. در صدر اين تواليها، DNA ماهوار39ه قرار دارد، که حاوي قطعات 100 جفت باز يا بيشر ميباشد که طول آنها به چندين مگا جفت باز نيز ميرسد. بعد از آن نوبت به ماهوارکها40 ميرسد که شامل رديفهاي تکراري بلندتر از 10 تا 15 جفت باز هستند که طول آنها 30 کيلوباز يا بيشتر است. کوچکترين عضو اين خانواده شامل تواليهاي ساده تکراري يا ريزماهواره41 ميباشد که شامل تواليهاي تکراري 6-1 جفت باز بوده و عموماً کوچکتر از يک کيلو باز ميباشند (چيمبرز و مکاووي42، 2002). ريزماهوارهها يا تواليهاي تکراري ساده (SSR)، عناصر تکراري متوالي و متشکل از واحدهاي تکي، دوتايي، سه تايي يا چهارتايي هستند (سلطانلو و همکاران، 1388) که در ژنوم بيشتر يوکاريوتها پراکندهاند. به طوري که در هر ده کيلو جفت باز از رديف DNA دست کم يک رديف ريزماهواره ديده ميشود (نقوي و همکاران، 1388). در گياهان عالي در هر 100-30 کيلوباز بطور ميانگين، يک SSR از نوع سه و چهار نوکلئوتيدي وجود دارد(سلطانلو و همکاران، 1388). ريزماهوارهها در DNA هستهاي تمام يوکاريوتها و پروکاريوتها از جمله باکتريها يافت شده (گابور43 و همکاران، 2000) و بطور مکرر بوجود ميآيند (گوپتا44 و همکاران، 1996). ريزماهوارهها در هر دو قسمت تواليهاي کدکننده و غير کدکننده در همه موجودات مورد مطالعه وجود دارند (کانتتي45 و همکاران، 2002). و ثابت شده که بطور يکنواخت در ژنوم پراکندهاند، اگر چه در برخي نواحي ميتوانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند (نقوي و همکاران، 1388).
کاربردهاي ريزماهوارهها در نقشهيابي ژنومي، انگشتنگاري DNA، نشانمند کردن ژنها، سازماندهي ژرمپلاسم و مطالعات سيتوژنتيکي مشخص شده است (گوپتا و همکاران، 199). از کاربردهاي ديگر ريزماهوارهها، ميتوان به عنوان نشانگرهايي جهت (نقشهيابي) ژنها در گندم و ساير گياهان اشاره کرد (خلستکينا46 و همکاران، 2002).
1-10-5- نشانگر مولکولي ISSR
روش ISSR-PCR براي اولين بار توسط زيتکيويز و همکاران (1994) گزارش شد. ISSRها نشانگرهاي نيمه اختياري هستند که توسط PCR در حضور آغازگري که مکمل ريزماهواره هدف است، تکثير ميشوند. تکثير در حضور اين آغازگرها به MP-PCR47 نيز معروف است. چنين تکثيري نياز به اطلاعات توالي نداشته و منجر به توليد الگوهاي چند جايگاهي و بسيار چند شکل ميگردد. قطعات ISSR، توالي DNA به طور 3000-100 جفت باز ميباشند که بين دو ناحيه ميکروستلايت48 که در جهت مخالف هم قرار گرفتهاند، جاي دارند. آغازگرهايي بر اساس ريزماهوارک طراحي و استفاده ميشوند تا توالي DNA بين دو ISSR را تکثير کنند ( کومار49 و همکاران، 2009).
طول آغازگرها ميتواند 16 تا 25 جفت باز باشد و ريزماهوارک استفاده شده ميتواند دو، سه، چهار يا پنج نوکلئوتيدي باشد. همچنين آغازگرها هم بصورت مهار نشده يا اکثراً مهار شده در انتهاي 3 يا 5′ توسط 1 تا 4 باز ميباشند. اين روش بخاطر استفاده از آغازگرهايي با طول بيشتر (16 تا 25) نسبت به RAPD با 10 نوکلئوتيد از تکرار پذيري بالاتري برخوردار است. زيرا در صورت استفاده از آغازگرهاي بلند ميتوان دماي اتصال (45 تا 69) را افزايش داد که اين امر سبب ميشود اختصاصيتر عمل کند. مطالعات انجام شده بر روي تکرارپذيري نشان ميدهد که فقط ضعيفترين باندها تکرارپذير نيستند. حدود 92 تا 95 درصد از باندهاي امتياز داده شده ميتوانند با استفاده از نمونه DNA از رقم مشابه و با استفاده از PCR جداگانه که با ژل اکريلآميد شناسايي شدهاند، تکرار شوند (ردي50 و همکاران، 2002) .
1-10-5-1-مزاياي ISSR
مهمترين مزيت ISSR اين است که هيچگونه اطلاعات در مورد تواليها براي ساخت آغازگر مورد نياز نيست. همچنين مقدار کمي از DNA

دیدگاهتان را بنویسید

Close Menu